DeCodiFi™ Long&Complex

DeCodiFi™ Long&Complex establece una base superior para la preparación de librerías a partir de cantidades ultrabajas de ADN de entrada, 1 ng, al desplazar la distribución de fragmentos hacia pesos moleculares más altos. A diferencia de otras polimerasas que generan smears estándar o artefactos inespecíficos, Long&Complex entrega la mayor concentración de librerías limpias y viables, necesarias para una reconstrucción genómica de alta fidelidad.

Figura 1: QC de amplificación de librerías. Comparación de los rendimientos de librerías de E. coli y S. epidermidis utilizando cinco polimerasas: DeCodiFi™ Long&Complex (L&C), KOD Xtreme™ Hot Start DNA Polymerase (KX), Q5® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (Q5), PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase (GXL) y LongAmp® Taq DNA Polymerase (LA). Las librerías se generaron utilizando el protocolo Ampli-Fi de PacBio, con 1 ng de ADN de entrada por reacción de 50 µL y un programa de amplificación estandarizado de 14 ciclos. Las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa para caracterizar la distribución de tamaño y el rendimiento antes de la secuenciación PacBio.

DeCodiFi™ Long&Complex facilita la reconstrucción a nivel cromosómico en el protocolo PacBio® Ampli-Fi™ al entregar las lecturas HiFi largas necesarias para resolver arquitecturas complejas. Al mantener una alta procesividad sin compresión de la longitud de los fragmentos, maximiza la contigüidad del ensamblaje en flujos de trabajo con cantidades ultrabajas de ADN de entrada.

Librerías de secuenciación de E. coli generadas mediante el protocolo PacBio® Ampli-Fi™. Las librerías fueron amplificadas utilizando DeCodiFi™ Long&Complex y polimerasas estándar de la industria, a partir de 1 ng de ADN de entrada en reacciones de 50 µL durante 14 ciclos. La completitud génica se evaluó utilizando BUSCO con el dataset enterobacterales_odb12 para E. coli. Para asegurar la compatibilidad, las muestras de E. coli fueron normalizadas a una profundidad uniforme de 63X, correspondiente a la muestra de menor cobertura para el genoma.

DeCodiFi™ Long&Complex optimiza el ensamblaje con Oxford Nanopore™ al capturar fragmentos ultralargos de hasta 47,1 kb. Al maximizar el alcance de los fragmentos, entrega un aumento del 65% en el Contig N50, permitiendo a los investigadores lograr una contigüidad de ensamblaje superior y mayor eficiencia en arquitecturas genómicas complejas mediante una cobertura optimizada y menores costos de secuenciación.

DeCodiFi™ Long&Complex está optimizada para templados desafiantes, incluyendo fragmentos largos de ADN de hasta 30 kb, regiones con alto contenido GC de hasta 90%, bajas cantidades de ADN y templados que contienen repeticiones de expansión.

DeCodiFi™ Long&Complex se recomienda para la amplificación por PCR de regiones de ADN con alto contenido GC o alta complejidad, incluyendo elementos regulatorios y secuencias repetitivas. También está diseñada para apoyar la amplificación de librerías en flujos de trabajo de secuenciación de lectura larga que involucran muestras de baja cantidad, genomas con alto contenido GC o targets largos que requieren alta fidelidad y desempeño robusto.

El 2X All-In-One Mix contiene DeCodiFi™ Hot-Start High-Fidelity Polymerase, dNTPs, MgCl₂, estabilizadores y potenciadores GC en un buffer propietario optimizado para una mayor cobertura. No incluye primers ni ADN templado.

Sí. Debido a la fuerte actividad proofreading 3′-exonucleasa de DeCodiFi™ Long&Complex, recomendamos incorporar dos enlaces fosforotioato en los extremos 3′ de los primers. Esta modificación previene la degradación de los primers, mejora la especificidad y minimiza la formación de dímeros de primers.

Prepara siempre las reacciones en hielo para proteger los primers de la actividad exonucleasa. Mezcla los componentes en un tubo o placa estéril, centrifuga brevemente y transfiere inmediatamente al termociclador. Para obtener resultados óptimos, recomendamos firmemente realizar un gradiente de temperatura, comenzando 4 °C por debajo del Tm calculado más bajo, para identificar la stringencia de annealing ideal.

La cantidad de templado debe calibrarse según la complejidad genómica. Apunta a al menos 10⁴ copias por reacción. Como referencia para una reacción de 25 µL:

Genomas procariontes: 5–10 ng, por ejemplo, >0,05 ng para E. coli.

Genomas eucariontes: 10–50 ng, por ejemplo, >34 ng para ADN genómico humano.

Plásmidos o fagos: ≤1 ng.

Usa una tasa de 30 segundos por kilobase. La temperatura óptima depende de tu objetivo:

• 68 °C: Recomendada para amplificación de librerías o cuando la prioridad es maximizar el rendimiento.

• 72 °C: Recomendada para PCR de amplicones, para asegurar mayor especificidad.

Nota: Para fragmentos repetitivos o productos inespecíficos, también se recomienda un programa step-down.

Los protocolos estándar utilizan entre 10 y 30 ciclos. Recomendamos usar el número mínimo de ciclos requerido para tu cantidad específica de ADN de entrada; menos ciclos reduce la probabilidad de errores estocásticos, productos inespecíficos y smearing.

Sí, se recomienda firmemente realizar una PCR con gradiente al establecer las condiciones de ciclado. Usa el Tm más bajo de los primers como referencia, comenzando 4 °C por debajo de ese valor y aumentando en incrementos de 2 °C hasta 4 °C por encima del Tm calculado.

Para repeticiones expandidas o amplificación inespecífica en amplicones largos, utiliza el programa de PCR step-down incluido en el protocolo. Para repeticiones expandidas con contenido 100% rico en GC, contacta a soporte técnico para recibir orientación sobre la solución más adecuada para tu aplicación.

Al recibir DeCodiFi™ Long&Complex, almacénalo a -20 °C y evita ciclos repetidos de congelación y descongelación. La mezcla está diseñada para transportarse entre 2–8 °C sin pérdida de desempeño por hasta 7 días, ayudando a reducir el uso de hielo seco y simplificar la logística. el uso de hielo seco y simplificar la logística.

Sí. Si trabajas con fragmentos largos, targets con alto contenido GC, regiones repetitivas, repeticiones de expansión o muestras de baja cantidad, nuestro equipo puede ayudarte a evaluar la cantidad de templado, el diseño de primers, las condiciones de ciclado, la configuración del gradiente y si una estrategia de PCR step-down es adecuada.

En flujos de trabajo de secuenciación de lectura larga basados en amplificación, la polimerasa puede influir en la distribución de longitudes de lectura, la representación GC y la compresión de la librería. Estos factores pueden afectar la contigüidad del ensamblaje downstream, especialmente cuando se parte de cantidades ultrabajas de ADN.