DeCodiFi™ Plant Direct

Sí. DeCodiFi™ Plant Direct está diseñado para permitir la amplificación directa a partir de extractos vegetales crudos, eliminando la necesidad de purificación de ADN. Aun así, se requiere un paso de preparación del extracto crudo antes de la PCR.

Puedes utilizar tu protocolo de lisis estándar o el protocolo de lisis HotSHOT recomendado en la ficha técnica de DeCodiFi Plant Direct. Este protocolo utiliza entre 1 y 4 mm² de tejido vegetal incubado en una solución de lisis alcalina a 95 °C, seguido de la adición de una solución de neutralización. El lisado resultante puede utilizarse directamente para PCR. Tanto la solución de lisis como la de neutralización pueden ser preparadas por el usuario o suministradas a solicitud con la compra.

Para una reacción de 25 µL, utiliza entre 1,25 y 5 µL de extracto vegetal crudo, lo que corresponde al 5–20% del volumen total de reacción. La mayoría de las especies vegetales muestran buen desempeño utilizando un 20% de extracto HotSHOT en la reacción de PCR.

Para plantas con altos niveles de inhibidores, como hojas de frutilla, el protocolo recomienda diluir el extracto HotSHOT 1:4 con agua libre de nucleasas y continuar utilizando un 20% del extracto diluido en la reacción de PCR.

El mix incluye DeCodiFi™ Hot-Start High-Fidelity Polymerase, dNTPs, magnesio, enhancers y estabilizadores propietarios. No incluye primers ni ADN templado.

Sí. Debido a que DeCodiFi™ tiene una fuerte actividad proofreading 3′-exonucleasa, el protocolo recomienda incorporar dos enlaces fosforotioato en los extremos 3′ de los primers. Esto ayuda a prevenir la degradación de los primers, mejorar la especificidad y reducir la formación de dímeros de primers. Utiliza primers de 20–28 nt de longitud, con 40–60% de contenido GC, preferentemente 50–60%, y valores de Tm similares, ≥60 °C. Evita la complementariedad en 3′, tramos largos de G/C y estructuras secundarias.

El programa de PCR recomendado comienza con 95 °C durante 2 minutos, seguido de 30–40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 segundos, annealing al Tm calculado durante 15 segundos y extensión a 72 °C durante 15 s/kb. Para templados ricos en GC, por sobre 70% GC, el protocolo recomienda utilizar 98 °C durante 10 segundos en la etapa de desnaturalización.

Sí. Se recomienda firmemente realizar una PCR con gradiente al establecer las condiciones de ciclado. Usa el Tm más bajo de los primers como referencia, comenzando 6 °C por debajo de ese valor y aumentando en incrementos de 2 °C hasta 6 °C por encima del Tm calculado.

Sí. DeCodiFi™ Plant Direct es compatible con PCR multiplex. El protocolo recomienda validar cada par de primers individualmente antes de multiplexar, utilizar primers con valores de Tm similares, comenzar con 0,05 µM de cada primer y ajustar la concentración de primers, la temperatura de annealing, el número de ciclos y el tiempo de extensión según el fragmento más largo de la mezcla.

Al recibir DeCodiFi™ Plant Direct, almacénalo a -20 °C y evita ciclos repetidos de congelación y descongelación. El mix está diseñado para transportarse entre 2–8 °C sin pérdida de desempeño por hasta 7 días.

DeCodiFi™ Plant Direct se recomienda para PCR directa, genotipificación por secuenciación y detección de transgenes a partir de material vegetal.